2.3高压制备方法的高压确定
初始方法为鲁南新时代生物技术有限公司在50mm高压制备液相(汉邦科技,制备型液相色谱系统,制备中试NS4000)上开发,纽莫是康定以二氯甲烷、甲醇和水体系制备纽莫康定B0,研究国内外未见具体报道。高压张宇等采用了氯仿、制备中试甲醇和水体系,纽莫笔者以二氯甲烷进行实验,康定毒性低于氯仿,研究价格也低于氯仿,高压放大生产具有一定的制备中试优越性。初始方法:将纽莫康定B0粗品(质量分数为81.2%,纽莫HPLC检测如图1所示,康定纽莫康定B0的研究色谱纯度为88.58%、纽莫康定C0的色谱纯度为8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解,波长276nm;柱温20~30℃;流量70mL/min;上样量1.7g;流动相,V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1;操作压力5~5.5MPa。收集B0的HPLC色谱纯度>95%的制备液。纽莫康定B0的色谱纯度值和纽莫康定C0的色谱纯度值是经过面积归一化法得到的。以线性原则放大到中试150mm制备柱(Cs-prep150工业制备色谱系统,汉邦科技),流量调整为630mL/min;进样量15.3g;其他不变。在此基础上,对该方法进行了进一步优化。
2.3.1流动相比例的优化
根据正相色谱特点,通过调控二氯甲烷,对流动相比例进行优化。在初始方法中,实验分析了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)的5个比例对纽莫康定B0制备分离的影响,实验结果如表2所示。
由表2可知:随着二氯甲烷比例的增加,纽莫康定B0峰的保留时间逐渐增加,B0峰分离度逐渐增大,B0峰和相邻峰的重合越小。其中,41∶9∶1和42∶9∶1的流动相比例相比,后者B0分离度高于前者,且B0峰型较好,保留时间相差不大。保留时间越长,生产成本越大。综合考虑B0的分离效果和生产成本,故选择V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1。
2.3.2上样量的优化
上样量在色谱制备中影响着目的峰的分离度及制备效率。因此,在流动相比例确定为V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1的基础上,实验选取了3种进样量(7.5,11.4,15.3g)对纽莫康定B0制备的效果进行研究,实验结果如表3所示。
上样量越大,分离度越小。对不同上样量下的B0峰进行分段收集,并对B0的HPLC色谱纯度大于95%的料液进行合并、减压浓缩和冻干,得到冻干粉的质量分别为3.01,4.7,4.8g。3种冻干粉B0质量分数分别为95.73%,95.77%,95.63%,相差不大。计算收率分别为47.31%,48.63%,36.95%,其表达式为
式中:X为上样液对应粗品质量;Y为粗品B0质量分数。
由表3可知:上样量11.4g收率高于上样量7.5,15.3g。收率高,则在中试、大生产中预示着低成本、高效益,以及制药企业在市场中较高的竞争力。因此,综合考虑对纽莫康定B0的分离效果和收率,选择11.4g上样量。
2.3.3洗脱流速的优化
在高压制备液相色谱中,洗脱流速影响柱压、峰型,进而影响到制备效率及效果。故在确定流动相比例V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1及上样量11.4g的基础上,考察了5个洗脱流速(480,530,580,630,680mL/min)对纽莫康定B0制备的影响,结果如表4所示。
由表4知:洗脱流速越大,柱压越高,峰型越窄。对不同洗脱流速下的B0峰进行分段收集,并对B0的HPLC色谱纯度大于95%的料液进行合并、减压浓缩和冻干。流速越大,得到的洗脱合并液体积逐渐减小,且减小幅度不大。最终得到的冻干粉质量分别为4.71,4.70,4.72,4.73,4.72g,其各数值相差很小。
随着流速的增加,柱压逐渐增加,而实验所用150mm高压制备系统工作压力为0~7MPa。随着进样次数的增加,柱压会逐渐增高,再生柱子会越频繁,如此会占用一定的工时和消耗再生溶剂,增加生产成本。另外,在5个流速下,冻干粉的收率和B0质量分数相差不大。综上考虑,优选480mL/min的流速作为150mm的制备柱流速。
2.4纽莫康定B0的高压色谱制备
以优化后的高压制备条件,在150mm制备柱上进行纽莫康定B0的制备。对B0峰分段收集,连续进样,合并纽莫康定B0的HPLC色谱纯度大于95%的制备液。将合并液进行减压浓缩,冻干,得到纽莫康定B0冻干粉。
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