导读

色谱素过滤膜后直接分析

建立了高效液相色谱法快速准确定量微量植物体中重要植物色素（叶绿素a、高效叶绿素b和叶黄素）的液相分析方法。微量植物叶片以95%乙醇匀浆超声提取色素4 h，色谱素过滤膜后直接分析。法准色谱分离选用COSMOSIL氰基柱（4.6 mm × 250 mm，确定5 μm），量微量植以甲醇-水洗脱进行洗脱，物体物色流速为1.0 mL/min，中的重植用二极管阵列检测器检测，高效可在15 min内完全植物中三种重要色素的液相快速分离分析。结果表明，色谱素三种色素在0.05～50 mg/L范围内线性关系良好（相关系数均为0.9999）；平均加标回收率为90%～110%；相对标准偏差（RSD）＜5%；日内及日间精密度均＜5%，法准满足定量要求。确定与目前检测植物色素的量微量植方法相比，该方法前处理简单快速，物体物色且采用简单的甲醇-水体系快速分离植物色素，结果可靠，重现性好，可为植物体的生理研究提供基础。
植物色素是植物体内能够吸收太阳光，并在光合作用时将光能转化为化学能的关键物质，同时植物的色泽和气味也受其色素的影响。在绿色植物中，叶绿素是其中最丰富的色素，经研究，通常情况下植物的光合速率随叶绿素含量的升高而增强，同时产量的高低基本依赖于光合速率的快慢。因而，叶绿素含量被普遍当作是一个能够准确评价植物的光合作用与产量产出的可靠指。叶绿素，分为叶绿素a和叶绿素b，其不溶于水，可溶于有机溶剂，属于脂溶性色素。颜色上，叶绿素a呈现蓝绿色，而叶绿素b呈现黄绿色；功能上，研究表明，叶绿素可有效地降低胆固醇、促进伤口愈合、解毒、抗癌等。除叶绿素外，叶黄素也广泛存在于各种植物以及蔬菜水果中，据相关研究，叶黄素不仅可以过滤蓝光、保护视网膜还能够抗氧化 。另外，一些恶劣的环境因素如低温、空气污染、营养缺乏、干旱等都会影响植物色素的含量与组成，进而影响植物的光合速率、香味和颜色。因此叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶黄素含量的准确测定对研究植物的光合生理与植物特性都具有重要意义。

目前，测定植物色素的常用方法紫外分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法等。高效液相-质谱联用技术有着高压、高速、以及高灵敏度的优点。该方法经液相色谱分离，比现有的紫外分光光度法具有更低的干扰及检出限；与荧光分析法相比，二极管阵列检测器更为普及。利用液相色谱定量检测植物色素含量准确率高。这3种色素结构相似、性质相近，有必要发展一种能够很好地分离3种色素且能准确定量的色谱方法。选择能获得对称峰形的色谱柱、合适的流动相以及合适的流动相比例对于植物体中叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素的色谱分离分析十分重要。

本文使用键合氰基的氰基色谱柱，以简单的甲醇和超纯水为流动相，建立一种快速定量分析植物体中叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素含量的反相高效液相色谱法，极大地提高了植物体中该3种重要色素含量准确测定的可靠性和速度，为研究植物体的生理特性提供了基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Shimadzu LCMS-2020型液相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）；COSMOSIL型氰基柱（日本半井公司）；FLUKO F6/10-8G型超细匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；Heraeus型高速低温离心机（韩国贺利氏公司）；百万分之一、十万分之一OHAUS型电子分析天平（美国奥豪斯公司）；Millipore Simplicity型超纯水系统（美国Merck公司）。

无水乙醇、0.45 μm过滤头、新鲜绿色植物叶片、甲醇（德国CNW公司）、叶绿素a标准品（99.9%）、叶绿素b标准品（99.9%）、叶黄素标准品（99.9%）（美国CIL公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备溶液：利用百万分之一天平准确称取0.5 mg叶绿素a标准品、叶绿素b标准品、叶黄素标准品，分别用95%乙醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，储存于-20 ℃冰箱，备用。

混合标准储备溶液：各取5 mL上述叶绿素a和叶绿素b的标准储备溶液混合，储存于-20 ℃冰箱，备用。

标准溶液的配制：用上述的混合叶绿素a和叶绿素b的标准储备溶液以及叶黄素分别逐级稀释，配制成浓度为0.05、0.5、2.0、10、50 mg/L的系列标准工作溶液。

1.2.2 植物样品的前处理

精密称取0.1 g的绿叶碎片以及绿叶根部各3份，分别加入1 mL 95%乙醇溶液，匀浆，匀浆后放置于冰箱中低温提取4 h，提取完毕后于4 ℃下高速离心20 min。低温离心后取上层绿色清液，过0.45 μm微孔滤膜后，置于2 mL液相小瓶中备用。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：氰基柱（4.6 mm × 250 mm，粒径5 μm），流动相：V（甲醇（A））：V（纯水（B））=76:24；流速为1 mL/min，二极管阵列检测器（PDA）波长为663 nm（叶绿素a）、645 nm（叶绿素b）、445 nm（叶黄素）；柱温箱温度40 ℃；进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 流动相的选择

目前，反相高效液相色谱检测植物色素的流动相复杂且分离效果差，难以达到准确定量的目的。本研究旨在采用常规流动相水，甲醇，乙腈或其中的两种到3种混合溶剂对植物中的色素进行分析。由于植物色素叶绿素a、叶绿素b以及叶黄素极性较小（下图为3种色素的化学结构），所以采用有机溶剂作为洗脱剂。此外，叶绿素a和叶绿素b结构相似，乙腈洗脱能力较甲醇强，若用乙腈作为洗脱液，两种色素难以分离，导致影响色素的准确定量，因此选用甲醇作为洗脱剂。用甲醇和纯水作流动相，实验中不断改变流动相的比例：V（甲醇）：V（水）为95:5、90:10、80:20、70:30。当流动相的V（甲醇）：V（水）=70:30时，叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的峰形较好，分离度符合要求，在20 min之内出峰。为了进一步缩短出峰时间，优化峰形，进一步优化洗脱流动相比例[17]，使得3种植物色素的出峰时间控制在15 min以内，最终选用V（甲醇）：V（水）=76:34为流动相进行绿色植物中叶绿素a、叶绿素b和叶黄素的分离。

被分析物的洗脱速率影响因素之一为流动相的流速[17]，流速的不同影响着物质在色谱中的出峰时间，在不干扰分离效果的条件下，同时节约时间成本，应尽量提高流动相的流速。综合各种因素，流速以1.0 mL/min为适中。

检测波长的选定是紫外及荧光类的检测器的关键。本研究采用的紫外检测器是全程扫描、二极管阵列的三维检测器，经过多次的尝试，确定叶绿素a的激发波长为663 nm；叶绿素b的激发波长为645 nm；叶黄素的激发波长为445 nm。

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