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选择丹磺酰氯作为衍生剂，其添加量优化结果见图1。生物色谱在丹磺酰氯添加量5～10mg/mL范围，高效随着添加量的液相增加，各生物胺的分析法峰面积增加；当丹磺酰氯添加量大于等于10mg/mL时，各生物胺峰面积不再随其添加量的白酒增加而增加，基本保持不变，和黄表明所衍生的酒中生物胺达到饱和状态。选取10mg/mL的生物色谱丹磺酰氯溶液作为本试验的衍生试剂。
比较ThermoHypersilGOLDC18柱（柱长250mm，柱内径4.6mm，分析法柱填料粒径5μm）与岛津InertsilODS-4C18柱（柱长150mm，白酒柱内径4.6mm，柱填料粒径5μm）对各生物胺的分离效果。经250mm色谱柱分离后，9种生物胺在37min内彼此分离且峰形对称。经150mm色谱柱分离后，37min内色谱图中只有8种生物胺的流出峰，无法在37min内分离9种生物胺。
流动相A与B的比例见表1。通过不断调整流动相A与B的含量，得到最优洗脱程序方案2。采用方案2对9种生物胺混标溶液进行洗脱分离，各生物胺流出峰彼此分离效果较好。
比较萃取处理对生物胺含量检测的影响。方案1直接对生物胺衍生，而方案2在对生物胺衍生之前进行萃取富集处理。选取尸胺、盐酸吡哆胺与β-苯乙胺3种生物胺，比较萃取处理对生物胺检测效果的影响，结果见表2。分析可知，对生物胺萃取处理后再衍生，生物胺损失程度减小，在样品复杂的基质中对生物胺的检测效果更佳，这说明对样品进行萃取、净化的重要性。
按照所建立的方法，将配制好的梯度系列标准溶液（50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05mg/L）进行线性试验。对标准溶液浓度（X）对其峰面积（Y）进行回归方程线性拟合，通过R2进行相关性评价。9种生物胺的检出限（LOD）与定量限（LOQ）通过3倍信噪比（S/N=3）与10倍信噪比（S/N=10）计算，结果见表3。优化的色谱条件程序洗脱后，混标中各生物胺色谱峰图如图1所示，各生物胺加标黄酒样品中的色谱峰图如图2所示。
由表3可知，9种生物胺在0.5～50mg/L质量浓度范围，该方法具有良好的线性关系，相关系数R2均大于0.998。检出限范围0.07～0.22mg/L，定量限范围0.07～0.73mg/L。分析图1与图2后发现37min洗脱与分离后，9种混合生物胺色谱峰先后流出，被成功分离。
选取3种生物胺做加标回收试验，向黄酒样品中加入3种浓度水平的混合标准溶液，加标量分别为1.0，5.0，10.0mg/L，其浓度均在线性范围。用所建立的方法进行前处理与测定，各加标水平样品平行测定3份，结果见表4。3种生物胺加标回收率在83.30%～114.70%之间，相对标准偏差（RＳD）均低于4.56%，说明该方法对生物胺的检测结果较为准确，重复性好。
用所建立的方法分析黄酒与白酒中生物胺含量，结果见表5和表6。由表5可知，黄酒中含有8种生物胺，总含量为29.39mg/L，各生物胺含量均有差异。色胺与尸胺为该黄酒样品中的主要生物胺，含量分别为（18.06±0.012）mg/L与（4.28±0.059）mg/L，β-苯乙胺含量为（1.21±0.021）mg/L，腐胺含量为（2.15±0.002）mg/L，盐酸吡哆胺含量为（2.45±0.028）mg/L，组胺含量为（0.40±0.049）mg/L，酪胺含量为（0.75±0.003）mg/L，亚精胺含量为（0.09±0.003）mg/L，精胺未检出。白酒检测结果见表6。白酒中生物胺总含量在3.83～7.94mg/L之间，其中组胺在4种白酒中被检出，精胺只在一种白酒中检出，其余7种生物胺在5种白酒中均被检出。比较黄酒与白酒中各生物胺含量可以发现，黄酒中的生物胺总含量高于白酒。这与之前研究报道一致。虽然二者均采用酿造工艺，但是后期工艺不同，黄酒无需蒸馏处理，而白酒需蒸馏处理，蒸馏后酒体中生物胺含量大大减少。另外，催化氨基酸脱羧转变成生物胺的脱羧酶，在pH4.04～4.33的黄酒酿造过程中被诱导合成，导致黄酒中生物胺含量相对较多。
采用HPLC-紫外检测法，丹磺酰氯柱前衍生梯度分离洗脱黄酒与白酒中的生物胺，在37min内实现了两种酒体中9种生物胺的分离。比较分析黄酒与白酒中生物胺含量，结果该方法准确性好，可快速检测9种生物胺含量。
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相关链接：丹磺酰氯，生物胺，白酒，盐酸吡哆胺
